制备型高速离心机的几种分离方法

A.差速离心：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的一些组份。 
差速离心是一种常用的方法。在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在速度下时间的离心后，就可得到两个部份：沉淀和上清液。 
通常在次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部份不需要的小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直到达到所需要的分离纯度为止。 
差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。 
B.密度梯度离心法：可以同时使样品中几个或全部组份分离，具有很好的分辨率。 
1)速率区带法(rate zonal)： 
根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下： 
在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管部至底部逐渐增加(正梯度)。 
将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。 
由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。  
2)等密度离心法(isopycnic)： 
根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。 
密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。注意：平衡后粒子的分离由其密度决定，与时间无关，此时再改变离心转速，只能改变区带的相对位置。 2.密度梯度分析法 
1)梯度介质性质与选择： 
A、应具备的性质 ： 
梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求，一个理想的密度材料标准它应是： 
· 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。 
· 具有某些性质，如折射率，据此可测定它的浓度。 
· 所形成的溶液粘度低。 
· 不损伤所分离的样品。 
· 离心分离后容易除去。 
· 不妨碍分离积分的分析。 
B、常用介质种类： 
表一、常用梯度材料在20℃密度 
B.梯度介质应用范围： 
表二、等密度梯度介质的应用 
+++很好 ++好 +可以 --不适用 
表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度 
(2)、梯度溶液的准备： 
计算 
稀释(本文三章部分) 
(3)、梯度形状 
梯度形状分：线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图) 
梯度形状对于分离是否成功重要： 
常用的是线型梯度，适用于分离蛋白质、酶、、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力，适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。 
B.梯度柱制备： 
梯度液柱可以用手工或梯度仪制备 
半注法： 
为缩减离心时间，或分离样品较少可用半注法：下半管铺置梯度介质，中间加样品，上面铺Buffer或液体石腊油。 
(4)、加样方法与加样量： 
将样品加到梯度液柱上，针尖和离心管成45-60°角度，慢慢地将样品沿管壁流到液面上去，对于DNA一类易断的脆弱样品，应该用孔径较大的移液管代替，以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。 
(5)、转子的选择与效应： 
(6)、分离区带的回收及检测